編者導(dǎo)語(yǔ)
非常榮幸邀請(qǐng)到袁超博士做客“臨床質(zhì)譜網(wǎng)媒體平臺(tái)”。我們會(huì)在“專(zhuān)家講壇”欄目中持續(xù)發(fā)布袁老師有關(guān)臨床質(zhì)譜的精彩干貨內(nèi)容，以饗讀者。本期袁老師為大家?guī)?lái)干擾物的精彩解讀。
作者簡(jiǎn)介
袁超博士
現(xiàn)任美國(guó)華人臨床化學(xué)學(xué)會(huì)主席，美國(guó)大型臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)室主任。于四川大學(xué)獲得生物化學(xué)學(xué)士學(xué)位、美國(guó)堪薩斯大學(xué)獲得生物化學(xué)博士學(xué)位，其后在霍普金斯和伊利諾伊大學(xué)做博士后，主要研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)組和質(zhì)譜。袁超博士最近十年主要從事臨床質(zhì)譜方法開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。
第十節(jié) 干擾物
干擾物是臨床檢測(cè)的方法驗(yàn)證里必做的一項(xiàng)。但是干擾物對(duì)不同的科室來(lái)說(shuō)，含義大不一樣。如果說(shuō)臨床化學(xué)是一棵樹(shù)的話，每一個(gè)科室，比如化學(xué)，免疫，還有質(zhì)譜，只是這棵樹(shù)上的一個(gè)分支。干擾物就像樹(shù)上的鳥(niǎo)，分別站在每一個(gè)枝頭。但是此鳥(niǎo)非彼鳥(niǎo)，化學(xué)方法里的干擾物在很多情況下是不會(huì)干擾免疫和質(zhì)譜方法的。但因?yàn)闅v史的原因，每次驗(yàn)證質(zhì)譜方法時(shí)都要把化學(xué)方法里的干擾物測(cè)一遍，而該測(cè)的干擾物往往漏掉了，在后來(lái)的工作中會(huì)造成麻煩。所以質(zhì)譜法的干擾物測(cè)定要有特殊的程序。
化學(xué)光吸收法里的干擾物主要是溶血，脂血，和黃疸，因?yàn)檫@些物質(zhì)都可能吸收、反射、或折射光波。免疫法里要測(cè)的干擾物應(yīng)當(dāng)包括各種自身抗體，人抗動(dòng)物抗體、抗試劑抗體、生物素、交叉反應(yīng)，等等能影響抗體抗原反應(yīng)的物質(zhì)。免疫法并不是一個(gè)直接的檢測(cè)手段，要通過(guò)抗原抗體的結(jié)合來(lái)發(fā)生。而抗體抗原反應(yīng)又比較復(fù)雜，容易被干擾。這也是大家普遍認(rèn)為質(zhì)譜法特異性更好的原因。在質(zhì)譜檢測(cè)里，被測(cè)物從上千種物質(zhì)里逐步被分離出來(lái)，最后撞在光電倍增管里，產(chǎn)生一個(gè)電子信號(hào)，作為定性和定量的基礎(chǔ)，其特異性是其它方法不可比擬的。但這不表示質(zhì)譜法里就沒(méi)有干擾物了。
在液質(zhì)聯(lián)用的方法里，能成為干擾物是一件很不容易的事情，必須和被測(cè)物是isocratic 和 isobaric。也就是說(shuō)在色譜上和在質(zhì)譜上都是分不開(kāi)的。色譜的分離是基于疏水性，分子結(jié)構(gòu)等理化性質(zhì)。如果某種物質(zhì)的理化性質(zhì)和被測(cè)物相近，那就會(huì)和被測(cè)物一起從色譜柱里出來(lái)。如果這個(gè)物質(zhì)不能被質(zhì)譜檢測(cè)到，那就只是會(huì)和被測(cè)物以及內(nèi)標(biāo)爭(zhēng)搶離子，形成離子抑制。如果它正好和被測(cè)物的分子量相同，而碰撞斷裂后有相同的離子片段，那就會(huì)被質(zhì)譜檢測(cè)到，成為“能看得見(jiàn)”的干擾物。
干擾物往往不會(huì)和被測(cè)物的保留時(shí)間完全一樣，這樣就形成了一個(gè)多余的峰肩，在主峰的前或后。干擾物的峰型有可能不對(duì)稱(chēng)，因?yàn)槲覀兊纳V梯度不是針對(duì)干擾物來(lái)設(shè)計(jì)的。這種情況下就會(huì)形成拖尾。這樣的峰與被測(cè)物的峰疊加在一起，形成不正常的峰型，很容易被看出來(lái)。不單單是被測(cè)物有干擾物，內(nèi)標(biāo)也會(huì)有干擾物。內(nèi)標(biāo)的干擾物往往會(huì)把內(nèi)標(biāo)的峰面積增加，很容易被看出來(lái)。在方法開(kāi)發(fā)時(shí)，可以做一批不加內(nèi)標(biāo)的病人樣品，看哪一個(gè)離子對(duì)比較干凈，就選用哪一個(gè)。方法開(kāi)發(fā)好上了臨床以后會(huì)碰到很多意想不到的問(wèn)題。一般一個(gè)新方法上臨床一年以后沒(méi)有問(wèn)題才算可靠。季節(jié)性的藥物，新藥，新的抽血的管子，新的試劑，新的包裝等等，這些都有可能含有干擾物。所以在方法開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證時(shí)可以多選用幾個(gè)備用的離子對(duì)，一旦有干擾物，可以頂上。一般選2-4個(gè)。
說(shuō)起離子對(duì)的選擇，這里面的學(xué)問(wèn)很多。大多數(shù)人是選豐度最高的那一個(gè)。我的經(jīng)驗(yàn)是選豐度高的離子對(duì)不如選特異性好的。掉水，掉氨基，掉羧基，掉甲基、掉乙基的離子對(duì)特異性都不會(huì)好；碎片是苯環(huán)或苯環(huán)類(lèi)似物的也不好；如果用延伸的話，要注意不要用延伸化試劑的離子。內(nèi)標(biāo)的片段最好也是選用特異性的片段。比如掉HDO的片段就比掉H2O的特異性高很多。實(shí)際情況不可能保證每個(gè)化合物都能找到2-4個(gè)可用的離子對(duì)。有時(shí)候只能退而求其次。甚至連【母離子-母離子】這樣的離子對(duì)我也用過(guò)。這個(gè)化合物就像個(gè)硬核桃，你用錘子敲它，勁兒使小了砸不開(kāi)；勁大了，砸碎了，一地渣渣，找不出一個(gè)可用的片段。我只好選用了一個(gè)比把它砸碎了的能量小一點(diǎn)的碰撞電壓，希望這個(gè)電壓能把可能有的干擾物砸碎，但我要的核桃還是完整的。另外一個(gè)比較奇特的例子是碰撞后的不穩(wěn)定性。這個(gè)化合物在碰撞后可以丟A基團(tuán)，也可以丟B基團(tuán)，但兩個(gè)的信號(hào)都不穩(wěn)定。這時(shí)候我選用了兩者之和，信號(hào)才算是穩(wěn)定下來(lái)了。不穩(wěn)定的情況還會(huì)發(fā)生在離子化這個(gè)階段，尤其是溶液中的離子，比如鹽，有可能附加在被測(cè)物之上，這樣的話，會(huì)造成信號(hào)不穩(wěn)。這個(gè)時(shí)候就要用一個(gè)小的電壓去敲一下被測(cè)物，希望能把這個(gè)附帶的離子敲下去。當(dāng)然，這一步發(fā)生在進(jìn)Q1之前，不同廠家對(duì)這個(gè)電壓有不同的叫法。在這個(gè)環(huán)節(jié)還有一個(gè)氣體，它的流動(dòng)方向是跟離子運(yùn)動(dòng)的方向是相反的。我的經(jīng)驗(yàn)是在不影響信號(hào)強(qiáng)度的情況下，把這個(gè)氣的流速調(diào)的越大越好。因?yàn)榉捶较虼?，可以把雜質(zhì)吹走。這個(gè)氣的使用和以前手工揚(yáng)麥的原理相似：麥子落下時(shí)，風(fēng)可以把癟的麥粒和麥皮給吹走了，飽滿的麥粒垂直落下來(lái)，被純化、富集。所以這個(gè)風(fēng)速要調(diào)到大的剛好吹不走麥粒，才能減少污染物，干擾物。建一個(gè)穩(wěn)定的、干凈的、污染物少的質(zhì)譜方法有很多竅門(mén)。因?yàn)槠拗疲也豢赡芤灰涣信e，先講到這里。關(guān)鍵是要對(duì)儀器的各種參數(shù)的了解、運(yùn)用、思考、和試錯(cuò)。
不管事前準(zhǔn)備的多充分，實(shí)際情況是出乎意料的復(fù)雜。干擾物的出現(xiàn)往往防不勝防。怎樣去發(fā)現(xiàn)有干擾物呢？除了看得見(jiàn)的峰型的改變，還有兩個(gè)指標(biāo)。一個(gè)是離子對(duì)的比值，一個(gè)是保留時(shí)間。如果我們檢測(cè)兩個(gè)以上離子對(duì)，那他們之間的比值應(yīng)該是相對(duì)固定的，如果偏高或偏低，那就是有干擾物了。偏高或偏低的界定在CLSI的法規(guī)里有。一般對(duì)低豐度的離子的要求相對(duì)較寬泛。所以在具體操作時(shí)可以在合乎規(guī)定的范圍內(nèi)做出對(duì)運(yùn)營(yíng)有利的選擇。比如人為的加大碰撞電壓，使定性的離子對(duì)的豐度降低，低到是定量的離子對(duì)的豐度的10%以下，這樣就可以按照規(guī)定選用一個(gè)比較寬的范圍。還有一些其它技巧，比如同一離子的多次使用，因?yàn)橛梦淖纸忉屍饋?lái)比較復(fù)雜，我就不在這里介紹了。法規(guī)里一個(gè)值得改進(jìn)的地方是對(duì)濃度低的要求應(yīng)該寬泛一些，因?yàn)檫@時(shí)候信號(hào)和噪音的差別已經(jīng)不大了，尤其是到了已經(jīng)沒(méi)有臨床意義的低濃度時(shí)。另外，廠家的軟件也有待改進(jìn)，濃度低時(shí)，如果離子對(duì)比值超標(biāo)，這樣的峰就不要特殊的標(biāo)出來(lái)了，直接給個(gè)小的定量就可以了；如果定的量在LOQ之下，就沒(méi)有必要再去深究是不是有干擾物把離子對(duì)的比值搞亂了。離子對(duì)的比值按理是應(yīng)該不變的，但是除了上述的濃度之外，還有其它因素。比如不同儀器，尤其是不同廠家的儀器之間；每次做完儀器維修之后；不同的流動(dòng)相，等等，這些因素都會(huì)改變不同離子對(duì)之間的比值。有的廠家的軟件設(shè)計(jì)的比較合理，是自動(dòng)選用同一批次里的標(biāo)準(zhǔn)品的離子對(duì)比值來(lái)衡量病人樣品。這樣就會(huì)把其它干擾因素給去掉。
從保留時(shí)間也可以看出有沒(méi)有干擾物。不是看絕對(duì)的保留時(shí)間，也不是看相對(duì)保留時(shí)間（相對(duì)保留時(shí)間是用在內(nèi)標(biāo)是類(lèi)似物的情況下），而是看被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間的差值。氘標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)疏水性差，從反向柱出來(lái)的時(shí)間會(huì)稍早一點(diǎn)兒。如果是被測(cè)物先出來(lái)的話，就有可能混的有干擾物了。具體用什么范圍來(lái)衡量要從實(shí)際中來(lái)。標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品干凈，沒(méi)有干擾物。把他們的時(shí)間差算個(gè)平均數(shù)，范圍是正負(fù)2SD或3SD就可以了。注意要在計(jì)算時(shí)把軟件里保留時(shí)間的小數(shù)點(diǎn)后面多放幾位。保留時(shí)間的差值超出范圍，甚至峰型都被改變了，也不見(jiàn)的就肯定有“看得見(jiàn)”的干擾物。有可能是“看不見(jiàn)”的干擾物搗的亂。這時(shí)，“看不見(jiàn)”的干擾物只抑制了被測(cè)峰的部分（前半部或后半部），所以才會(huì)把峰型搞亂，把保留時(shí)間擠的靠前或靠后，這時(shí)候可以用稀釋法來(lái)檢測(cè)（見(jiàn)上節(jié)）。最麻煩的是“看得見(jiàn)”和“看不見(jiàn)”的干擾物同時(shí)存在，使得結(jié)果很不可靠。這時(shí)候就只能說(shuō)“因?yàn)橛懈蓴_物而出不了報(bào)告了”。另外干擾物有可能是上一個(gè)樣品里的，因?yàn)樯V沒(méi)有洗干凈，雜質(zhì)被帶到了下一個(gè)樣品里來(lái)了。把被干擾的樣品重新上次一樣就可以解決這個(gè)問(wèn)題。有的雜質(zhì)多的樣品會(huì)干擾接下來(lái)的兩個(gè)，甚至三個(gè)樣品，或者直接就把色譜柱子給毀了。重復(fù)測(cè)一次，它又毀一根柱子。這種時(shí)候 ，我都想找客戶(hù)倒賠我們錢(qián)。這種都是極端的例子，有些確實(shí)是因?yàn)椴∪嗽谶M(jìn)行一項(xiàng)特殊的治療，血液里有大量的特殊藥物。如果這種毀柱子的情況經(jīng)常出現(xiàn)的話，說(shuō)明方法不夠好，需要把樣品弄的更干凈些再進(jìn)樣。
如前所述，如果某個(gè)病人的內(nèi)標(biāo)的峰面積過(guò)大時(shí)，也可能是因?yàn)楦蓴_物引起的。所以?xún)?nèi)標(biāo)最好也要使用幾個(gè)離子對(duì)。很多法則里對(duì)內(nèi)標(biāo)的離子對(duì)數(shù)目沒(méi)有硬性規(guī)定。但是我個(gè)人感覺(jué)還是有至少兩個(gè)比較好。
另外，還要把干擾物和污染物區(qū)別開(kāi)。污染物就是被測(cè)的物質(zhì)，但是不應(yīng)該出現(xiàn)在樣品里。它的產(chǎn)生原因五花八門(mén)。例如實(shí)驗(yàn)操作不規(guī)范，使用天平時(shí)沒(méi)有清理干凈，把后面的試劑、溶液給污染了；廠商在產(chǎn)品制造過(guò)程過(guò)程中無(wú)意中引進(jìn)的污染；員工本身無(wú)意引進(jìn)的污染（吸煙者的尼古丁，懷孕婦女超高的雌激素，等等）。這種情況下，空白和雙空白可以看出來(lái)。另外每次從廠家收到內(nèi)標(biāo)以后，都要單獨(dú)檢測(cè)一下，看里面有沒(méi)有不帶標(biāo)記的被測(cè)物。雖然軟件里可以用數(shù)學(xué)的方法把內(nèi)標(biāo)里混進(jìn)去的被測(cè)物去掉，但最好是拿到干凈的內(nèi)標(biāo)為最好。
如果真的出現(xiàn)干擾物了，怎么辦？首先是換一下離子對(duì)，看問(wèn)題能不能解決。如果備用的離子對(duì)是好的，而且也被驗(yàn)證過(guò)，那報(bào)告是可以出的。如果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)被干擾的樣品都可以用備用的離子對(duì)解決，那可以考慮永久的換一下離子對(duì)。有時(shí)候自己實(shí)驗(yàn)室解決不了，可以把樣品送到其他實(shí)驗(yàn)室，換一個(gè)方法說(shuō)不定就不干擾了。
建質(zhì)譜方法時(shí)，要測(cè)試可能成為干擾物的類(lèi)似物?？梢圆槲墨I(xiàn)看以前有哪些報(bào)道；可以查分子庫(kù)，看有沒(méi)有分子量相近的化合物。有的話，要拿來(lái)測(cè)一測(cè)。這個(gè)要比測(cè)溶血，脂血更有意義。
本節(jié)的總結(jié)：
1. 質(zhì)譜法的干擾物有別于其他方法，只有色譜和質(zhì)譜都分不開(kāi)的物質(zhì)才有可能成為干擾物。
2. 干擾物可以從峰型，保留時(shí)間，和離子豐度比值來(lái)鑒定出來(lái)。
3. 解決干擾物的問(wèn)題要從建方法時(shí)開(kāi)始，需要有大量的儀器操作和方法開(kāi)發(fā)的經(jīng)驗(yàn)。
4. 真是有解決不了的問(wèn)題，只能老老實(shí)實(shí)的在報(bào)告里說(shuō)明，不要把不可靠的結(jié)果上傳。
聲明：本文章來(lái)源“臨床質(zhì)譜網(wǎng)”，作者：袁超博士，豪思生物已獲得臨床質(zhì)譜網(wǎng)和袁超博士授權(quán)，如需轉(zhuǎn)載，請(qǐng)聯(lián)系原作者！
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