編者導(dǎo)語(yǔ)
非常榮幸邀請(qǐng)到袁超博士做客“臨床質(zhì)譜網(wǎng)媒體平臺(tái)”。我們會(huì)在“專(zhuān)家講壇”欄目中持續(xù)發(fā)布袁老師有關(guān)臨床質(zhì)譜的應(yīng)用、標(biāo)準(zhǔn)品、線性、權(quán)重、同位素內(nèi)標(biāo)、離子抑制、基質(zhì)效應(yīng)等精彩干貨內(nèi)容，以饗讀者。承接上期，本期袁老師為大家?guī)?lái)基質(zhì)效應(yīng)的精彩解讀。
作者簡(jiǎn)介
袁超博士
現(xiàn)任美國(guó)華人臨床化學(xué)學(xué)會(huì)主席，美國(guó)大型臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)室主任。于四川大學(xué)獲得生物化學(xué)學(xué)士學(xué)位、美國(guó)堪薩斯大學(xué)獲得生物化學(xué)博士學(xué)位，其后在霍普金斯和伊利諾伊大學(xué)做博士后，主要研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)組和質(zhì)譜。袁超博士最近十年主要從事臨床質(zhì)譜方法開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。
第九節(jié) 基質(zhì)效應(yīng)
上一節(jié)講到離子抑制是由于病人的樣品“臟”，其中的某些物質(zhì)抑制了被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的離子化程度導(dǎo)致的質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)降低。注意，這里的“臟”和“抑制”都是一個(gè)相對(duì)的概念，是相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)說(shuō)的。標(biāo)準(zhǔn)品一般是配置在相對(duì)“干凈”的基質(zhì)里的，雜質(zhì)相對(duì)較少，對(duì)離子化的抑制相對(duì)不明顯。所以我們加相同量的內(nèi)標(biāo)在標(biāo)準(zhǔn)品和病人樣品里，標(biāo)準(zhǔn)品里的內(nèi)標(biāo)信號(hào)要高一些，病人樣品里的內(nèi)標(biāo)信號(hào)要低一些。怎樣選擇配標(biāo)準(zhǔn)品的基質(zhì)是另外一個(gè)話題，在本節(jié)末會(huì)提到。病人樣品里的內(nèi)標(biāo)信號(hào)低并不等同于測(cè)得的結(jié)果低，因?yàn)楸粶y(cè)物和內(nèi)標(biāo)的信號(hào)都被抑制了，而我們做定量用的是被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的比值，在分子和分母都降低相同程度的情況下，比值是不變的，算出來(lái)的濃度也是不變的。這種情況下，我們說(shuō)有離子抑制，但是沒(méi)有基質(zhì)效應(yīng)。這也是我們引入內(nèi)標(biāo)的初衷，用內(nèi)標(biāo)去模擬被測(cè)物的行為，在此消彼消，此長(zhǎng)彼長(zhǎng)中保證最后定量結(jié)果的準(zhǔn)確。
我對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的理解是：同樣濃度的被測(cè)物放在病人的基質(zhì)里跟放在標(biāo)準(zhǔn)品的基質(zhì)里產(chǎn)生的定量結(jié)果是不一樣的?；|(zhì)效應(yīng)在臨床檢測(cè)上是一個(gè)被普遍接受的概念，各個(gè)科室的人都知道。在質(zhì)譜方法里，基質(zhì)效應(yīng)往往和離子抑制聯(lián)系起來(lái)。離子抑制是質(zhì)譜法獨(dú)有的，別的實(shí)驗(yàn)室的人可能從來(lái)沒(méi)聽(tīng)說(shuō)過(guò)。離子抑制可以導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)，離子抑制也可以不導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)（如上面舉的例子）。另外，其他的因素也可以導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)。
我們先來(lái)看一看因?yàn)殡x子抑制導(dǎo)致的基質(zhì)效應(yīng)。如果病人樣品里的臟東西對(duì)被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的抑制程度不一樣，基質(zhì)效應(yīng)就會(huì)產(chǎn)生了。比如被測(cè)物被抑制了50%，而內(nèi)標(biāo)只被抑制了25%，他們的比值就會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致結(jié)果出錯(cuò)。為什么被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)會(huì)被抑制到不同程度呢？我還沒(méi)有看到一個(gè)完全令人信服的確鑿說(shuō)法。這里給大家提供幾個(gè)比較流行的解釋。第一是內(nèi)標(biāo)不好。內(nèi)標(biāo)不是被測(cè)物的穩(wěn)定同位素標(biāo)記的，出峰時(shí)間不一樣。那就會(huì)產(chǎn)生如下這種可能，“臟”東西只是抑制了被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的其中一個(gè)，另外一個(gè)沒(méi)有被抑制，或者抑制的少，這樣就會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。第二種解釋是，雖然用了同位素內(nèi)標(biāo)，但是氘標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)疏水性要差一些，出峰要早一些，還是有可能造成被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)之間的不同程度的抑制。這個(gè)說(shuō)法聽(tīng)上去似乎有理，但是真正用實(shí)驗(yàn)去檢測(cè)的話，結(jié)果也不是那么讓人信服（有文獻(xiàn)佐證）。尤其是當(dāng)用了碳13的內(nèi)標(biāo)時(shí)，還出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)，那就更不好解釋了，因?yàn)樘?3的內(nèi)標(biāo)理論上應(yīng)該是不改變保留時(shí)間的。
臨床檢測(cè)有很多謎團(tuán)，質(zhì)譜里的基質(zhì)效應(yīng)的成因就是一個(gè)。我們可以很清楚的看到基質(zhì)效應(yīng)（下面會(huì)有解釋?zhuān)?，但是我們就是不知道到底是什么產(chǎn)生了基質(zhì)效應(yīng)。以往的解釋往往集中在離子化這一步，其實(shí)其它的步驟，比如樣品制備這個(gè)環(huán)節(jié)，也可能產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。我還沒(méi)有看到過(guò)相關(guān)的發(fā)表文章，只是從自己的經(jīng)驗(yàn)里做一些推導(dǎo)和猜測(cè)。
內(nèi)標(biāo)是外源性的，它要被加到樣品里。加到樣品里以后要和樣品里的物質(zhì)產(chǎn)生各種理化關(guān)系。如果這種關(guān)系在標(biāo)準(zhǔn)品的基質(zhì)里和在病人樣品的基質(zhì)里不同，而這種不同會(huì)在以后的步驟里產(chǎn)生對(duì)定量結(jié)果的影響，那么基質(zhì)效應(yīng)就能產(chǎn)生了。到底是什么樣的理化關(guān)系會(huì)影響到定量呢？跟蛋白結(jié)合就是一個(gè)。病人的樣品里有各種蛋白，內(nèi)標(biāo)加進(jìn)去以后可以和某些蛋白結(jié)合。而標(biāo)準(zhǔn)品太干凈，某些蛋白不存在，其它的蛋白和內(nèi)標(biāo)結(jié)合的不是很迅速，需要一些時(shí)間才能達(dá)到平衡。而被測(cè)物在標(biāo)準(zhǔn)品和在病人樣品里都已經(jīng)放了很久了，該結(jié)合的都已經(jīng)結(jié)合了，該平衡的早已經(jīng)平衡了。這時(shí)候，如果樣品制備好了就上樣，標(biāo)準(zhǔn)品里內(nèi)標(biāo)還沒(méi)有來(lái)得及跟蛋白結(jié)合，游離態(tài)的多；病人樣品里的內(nèi)標(biāo)瞬時(shí)就跟蛋白結(jié)合了，游離態(tài)的少。在樣品前處理中，第一步往往是把大分子蛋白去掉。這時(shí)候如果內(nèi)標(biāo)是跟蛋白結(jié)合的，也會(huì)被一起去掉；如果是游離的，則會(huì)被保留。如此一來(lái)，內(nèi)標(biāo)在標(biāo)準(zhǔn)品和病人基質(zhì)里跟蛋白結(jié)合的差別，就會(huì)導(dǎo)致定量的偏差。如果樣品制備好以后放置一會(huì)兒，讓游離態(tài)和結(jié)合態(tài)在每個(gè)樣品里都達(dá)到最終的動(dòng)態(tài)平衡，就不會(huì)有基質(zhì)效應(yīng)，測(cè)得的結(jié)果就是對(duì)的。我沒(méi)有做過(guò)任何實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證這個(gè)說(shuō)法，這些假設(shè)和推導(dǎo)都是在我的腦子里完成的。讀者沒(méi)有必要接受我的說(shuō)法，我只是想提供一些思路，讓大家不要專(zhuān)注于離子化這一個(gè)步驟去解釋基質(zhì)效應(yīng)。
基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的原因就討論到這里，下面我們來(lái)討論檢測(cè)基質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方法。文獻(xiàn)上有很多方法，以前工作過(guò)的科研團(tuán)隊(duì)對(duì)這個(gè)課題下了大功夫研究。大家的意見(jiàn)從剛開(kāi)始的盲目崇拜文獻(xiàn)，到后來(lái)的各抒己見(jiàn)、各持己見(jiàn)，然后用數(shù)據(jù)說(shuō)話，最后成文在實(shí)驗(yàn)室自己撰寫(xiě)的方法驗(yàn)證指導(dǎo)手冊(cè)里。其中的主要觀點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)步驟發(fā)表在幾篇不同的文章里。這里我簡(jiǎn)要談一下。驗(yàn)證有沒(méi)有基質(zhì)效應(yīng)要遵循以下幾個(gè)原則：第一，自變量（x軸）一定要是不同的基質(zhì)；因變量（y軸）一定要是被檢測(cè)物質(zhì)的濃度，或者是能代表濃度的【被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值】。離開(kāi)了這個(gè)原則的實(shí)驗(yàn)，不管在文獻(xiàn)里、在法規(guī)里有多推崇，我們看了只能是呵呵。第二個(gè)原則是可操作性。“不想當(dāng)將軍的士兵不是好士兵”。我想說(shuō)的是“沒(méi)打過(guò)槍的將軍也不會(huì)是個(gè)好將軍”。沒(méi)有一點(diǎn)兒實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)，光靠理論設(shè)計(jì)出來(lái)的實(shí)驗(yàn)，往往看上去很美好，但操作起來(lái)讓人很抓狂。有的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的紛繁復(fù)雜，恨不得一網(wǎng)打盡所有的要素，反而在實(shí)際操作中顧此失彼，丟了西瓜，也丟了芝麻，讓人真想把寫(xiě)規(guī)則的人叫過(guò)來(lái)，給我們演示一遍。你能做出來(lái)了，我們?cè)僮觥?/p>
埋怨的話就說(shuō)到這兒。下面談?wù)勎覀兪窃趺唇鉀Q問(wèn)題的。理論上很簡(jiǎn)單，為了證明沒(méi)有基質(zhì)效應(yīng)，只要在不同的基質(zhì)里加相同的被測(cè)物，看測(cè)得的濃度是否一致就可以了。但這樣的實(shí)驗(yàn)說(shuō)起來(lái)簡(jiǎn)單，做起來(lái)可不簡(jiǎn)單。標(biāo)準(zhǔn)品基質(zhì)還好說(shuō)，不同病人的基質(zhì)就不好辦了。每個(gè)病人的樣品就一點(diǎn)兒，又不能把不同病人的樣品混在一起，那怎樣準(zhǔn)確的加進(jìn)去固定濃度的被測(cè)物？被測(cè)物不能加干粉，必須是溶液。溶液加多了會(huì)改變基質(zhì)，溶液加少了，變數(shù)會(huì)增大。一個(gè)病人的樣品就1-2個(gè)毫升，還要預(yù)留出來(lái)一些測(cè)本底。最多能加個(gè)幾十微升的溶液。這么小的體積，準(zhǔn)確的稱(chēng)量是個(gè)問(wèn)題，而且這還大多數(shù)是有機(jī)溶劑。小體積的有機(jī)溶劑稱(chēng)量、轉(zhuǎn)移，麻煩多多。蒸發(fā)是個(gè)問(wèn)題，蒸發(fā)后產(chǎn)生的壓力會(huì)把液體擠出去。用針筒沒(méi)有蒸發(fā)，但是有其它問(wèn)題：針筒是經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)的嗎？針筒洗不洗？怎么洗？如果這一步的變數(shù)太大，我們?cè)趺粗榔浜鬁y(cè)得的濃度的偏差是由于基質(zhì)效應(yīng)引起的，還是因?yàn)榧訕拥淖償?shù)引起的？
經(jīng)過(guò)兩年多的探討和摸索，我們最后制定的解決方案是一個(gè)“混合實(shí)驗(yàn)”。原理是把一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和一個(gè)病人樣品按1:1混合。如果混合物的數(shù)值正好是在標(biāo)準(zhǔn)品和病人的正中間，那就沒(méi)有基質(zhì)效應(yīng)，反之則有。正好是中間值不太可能，只要跟中間值的偏差在20%以?xún)?nèi)就可以。一次的混合實(shí)驗(yàn)是不夠的，建議做十次：5個(gè)女性病人加上5個(gè)男性病人。這樣做的好處是滿足了前面我說(shuō)的兩個(gè)原則。x軸是不同的基質(zhì)（標(biāo)準(zhǔn)品、病人、1:1的混合基質(zhì)），y軸是被測(cè)物的濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的很簡(jiǎn)單，這就滿足了第二個(gè)原則。把1毫升的標(biāo)準(zhǔn)品和1毫升的病人樣品混合，這個(gè)操作起來(lái)不難，準(zhǔn)確度也好。具體的實(shí)驗(yàn)步驟文獻(xiàn)里有，我就不重復(fù)了。
前面討論了基質(zhì)效應(yīng)的成因和檢測(cè)。下面我們來(lái)看，如果有了基質(zhì)效應(yīng)，我們?cè)趺窗阉サ簟?/p>
首先要確定內(nèi)標(biāo)是穩(wěn)定同位素標(biāo)記的，內(nèi)標(biāo)碎片應(yīng)該和被測(cè)物的碎片一致的。如果內(nèi)標(biāo)已經(jīng)很好，或沒(méi)有更好的了，那下一步就是換標(biāo)準(zhǔn)品的基質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)品基質(zhì)的選擇有幾個(gè)注意事項(xiàng)。最重要的是commutability，要能和病人樣品互換而不產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。檢測(cè)方法是用上面的混合實(shí)驗(yàn)。一個(gè)一個(gè)的基質(zhì)試，看哪個(gè)能通過(guò)就用哪個(gè)。另外，標(biāo)準(zhǔn)品的基質(zhì)還不能有本底，這對(duì)內(nèi)源性物質(zhì)是個(gè)挑戰(zhàn)。外源性物質(zhì)，比如藥物，做一個(gè)隱性病人的pool就可以拿來(lái)當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的基質(zhì)了。這樣的標(biāo)準(zhǔn)品基質(zhì)保證commutability好，因?yàn)樗褪遣∪说臉悠贰?nèi)源性的物質(zhì)就要考慮空白血清，牛血清蛋白溶液，生理鹽水，有機(jī)溶劑，水（排名不分前后，只是從復(fù)雜到簡(jiǎn)單）來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)品的基質(zhì)了。只要能保證commutability，溶解性好，保質(zhì)期長(zhǎng)，容易配置和儲(chǔ)存，我建議怎么簡(jiǎn)單怎么來(lái)，不一定非要用空白血清。能通過(guò)混合實(shí)驗(yàn)的基質(zhì)也可以拿來(lái)稀釋濃度超高的病人樣品。因?yàn)闆](méi)有基質(zhì)效應(yīng)，稀釋后的結(jié)果是可信的。與標(biāo)準(zhǔn)品基質(zhì)的選擇不同，質(zhì)控品的基質(zhì)最好要跟病人樣品相似，最好有一個(gè)質(zhì)控就是病人樣品的pool。這樣即使有因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品跟病人樣品的基質(zhì)不同造成的定量的偏差（基質(zhì)效應(yīng)），病人pool做的質(zhì)控能把這個(gè)偏差反映出來(lái)，不至于上傳錯(cuò)誤的病人結(jié)果。
最后的補(bǔ)救辦法是優(yōu)化樣品的制備?？煽紤]的選項(xiàng)有：確保內(nèi)標(biāo)有充分的時(shí)間達(dá)到平衡態(tài)，改變pH值或有機(jī)溶液濃度，以求快速達(dá)到平衡態(tài)，復(fù)融在起始流動(dòng)相里，進(jìn)一步純化樣品等等。改變色譜和質(zhì)譜的參數(shù)也能影響到基質(zhì)效應(yīng)。但這中間就需要大量的經(jīng)驗(yàn)和試錯(cuò)了。這個(gè)只能從實(shí)際操作中得來(lái)。由于篇幅有限，我沒(méi)法面面俱到，我下面只講一個(gè)例子。
檢測(cè)離子抑制有一個(gè)postcolumn infusion實(shí)驗(yàn)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)里，內(nèi)標(biāo)被infuse到柱后的流動(dòng)相里。進(jìn)的樣是處理好了的沒(méi)有加內(nèi)標(biāo)的病人樣品。檢測(cè)的是內(nèi)標(biāo)的信號(hào)。主要看內(nèi)標(biāo)的信號(hào)在出峰的時(shí)間有沒(méi)有被抑制（相對(duì)于空白或標(biāo)準(zhǔn)品）。我的經(jīng)驗(yàn)是不但要看絕對(duì)的抑制，還要看出峰的時(shí)候，內(nèi)標(biāo)是不是變化很大。變化大有兩個(gè)含義。第一個(gè)含義是不同病人之間的變化大；第二個(gè)含義是同一個(gè)樣品里，內(nèi)標(biāo)信號(hào)在出峰時(shí)候變化大（信號(hào)變化的坡度陡代表變化大）。如果病人之間差別巨大，或者出峰是在一個(gè)陡坡上的話，最好換一下洗脫梯度，流動(dòng)相，色譜柱，以期達(dá)到讓峰在一個(gè)相對(duì)信號(hào)平穩(wěn)的時(shí)候出來(lái)，這樣可以增加信號(hào)的穩(wěn)定性，對(duì)減少基質(zhì)效應(yīng)也有幫助。
這一節(jié)內(nèi)容就到此結(jié)束，最后總結(jié)一下討論過(guò)知識(shí)點(diǎn)。
1. 基質(zhì)效應(yīng)可以發(fā)生在離子化這一步，也可能發(fā)在樣品制備或其它的步驟。
2. 基質(zhì)效應(yīng)可以用一個(gè)簡(jiǎn)單的混合實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。
3. 去掉基質(zhì)效應(yīng)的方法有三：換內(nèi)標(biāo)，換基質(zhì)，換方法。
聲明：本文章來(lái)源“臨床質(zhì)譜網(wǎng)”，作者：袁超博士，豪思生物已獲得臨床質(zhì)譜網(wǎng)和袁超博士授權(quán)，如需轉(zhuǎn)載，請(qǐng)聯(lián)系原作者！
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