編者導(dǎo)語(yǔ)
非常榮幸邀請(qǐng)到袁超博士做客“臨床質(zhì)譜網(wǎng)媒體平臺(tái)”。我們?cè)?ldquo;專家講壇”欄目中持續(xù)發(fā)布袁老師有關(guān)臨床質(zhì)譜的應(yīng)用、標(biāo)準(zhǔn)品、線性、權(quán)重、同位素內(nèi)標(biāo)、離子抑制、基質(zhì)效應(yīng)等精彩干貨內(nèi)容，以饗讀者。承接上期，本期袁老師為大家?guī)?lái)離子抑制的精彩解讀。
作者簡(jiǎn)介
袁超博士
現(xiàn)任美國(guó)華人臨床化學(xué)學(xué)會(huì)主席，美國(guó)大型臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)室主任。于四川大學(xué)獲得生物化學(xué)學(xué)士學(xué)位、美國(guó)堪薩斯大學(xué)獲得生物化學(xué)博士學(xué)位，其后在霍普金斯和伊利諾伊大學(xué)做博士后，主要研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)組和質(zhì)譜。袁超博士最近十年主要從事臨床質(zhì)譜方法開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。
第八節(jié) 離子抑制
要想理解質(zhì)譜里的基質(zhì)效應(yīng)，必須先了解離子抑制。這兩個(gè)概念有很大的關(guān)聯(lián)性，但絕對(duì)不是同一回事。就好像收入和利潤(rùn)的關(guān)系，都跟掙錢有關(guān)，但差別還是相當(dāng)顯著的。
同樣量的內(nèi)標(biāo)加在不同的樣品里，最后出來(lái)的內(nèi)標(biāo)的豐度不盡相同，這里面有很多原因。隱藏在其中的一個(gè)原因就是離子抑制。要想理解離子抑制，咱們先得把其它的原因去除掉。
第一個(gè)原因就是LCMS本身的變數(shù)。即便是同一個(gè)樣品，比如一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)幾遍，每遍的結(jié)果都不會(huì)完全相同。那同一個(gè)樣品測(cè)n遍，怎樣的CV才算可以接受呢？這個(gè)沒(méi)有統(tǒng)一的規(guī)定，當(dāng)然越小越好。有些檢測(cè)項(xiàng)目的最大允許誤差（total allowable error，簡(jiǎn)稱TEa）是公布了的，一般在20% 到30%之間。所以同一個(gè)樣品由不同的人在不同的日子里測(cè)n遍，一般小于20%的CV是可以接受的。但這個(gè)20%包括了人與人，天與天之間的差別。連續(xù)測(cè)同一個(gè)樣品的CV要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于20%才行。我自己的標(biāo)準(zhǔn)是3-6%。3%是優(yōu)秀，6%是及格。這就好像我總共有20塊錢來(lái)吃午飯，我可以拿出來(lái)3到6塊花在路費(fèi)上，剩下的錢用來(lái)買飯。要是花了15塊路費(fèi)，這午餐就很緊張了，很容易超支。這樣的方法就不要往下做了，需要反爐重新優(yōu)化。
這個(gè)3-6%是指濃度，或者被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的比值的CV。如果只算內(nèi)標(biāo)峰面積的CV，我個(gè)人認(rèn)為應(yīng)該在6-10%之間，6%是優(yōu)秀，10%是及格。根據(jù)是什么呢？沒(méi)有非?？茖W(xué)的根據(jù)，自己的經(jīng)驗(yàn)得來(lái)的。如果非要找根據(jù)，那就是sigma了。20%除以6%是三，20%除以3%是六；三個(gè)sigma是及格，六個(gè)sigma是優(yōu)秀。sigma的算法和意義以后再討論。內(nèi)標(biāo)的CV一般會(huì)比【被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的比值】的CV大一些，翻個(gè)一番，到6%～10%的范圍，是正常的。這也是我們?yōu)槭裁从脙?nèi)標(biāo)的初衷，就是用來(lái)消減被測(cè)物信號(hào)的CV。
同一個(gè)樣品測(cè)n遍，內(nèi)標(biāo)的CV在10%以內(nèi)；那同樣的量的內(nèi)標(biāo)放在不同的病人樣品里，怎樣的CV算合適呢？沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，你個(gè)人認(rèn)為把10%再翻一番，20%。這個(gè)值還是越小越好。能做到10%以內(nèi)就算好方法了，這樣的方法上了臨床以后麻煩也會(huì)少。需要注意一點(diǎn)的是要讓儀器預(yù)熱好了再測(cè)，要不然的話，內(nèi)標(biāo)變化過(guò)大有可能是儀器還沒(méi)有穩(wěn)定造成的。尿液里的成分變化太大，很難達(dá)到小于20%的要求，可以放寬一些，甚至到50%。這樣做是合適的，因?yàn)槟蚶锏臐舛纫呀?jīng)跟血液濃度沒(méi)有嚴(yán)格的相關(guān)性了，定性大于定量，除非是24小時(shí)尿。如果對(duì)尿液濃度的測(cè)量真的要求很高，那最好還是把CV做到20%以內(nèi)。如果被測(cè)物濃度夠高或者質(zhì)譜儀夠靈敏，那么一個(gè)簡(jiǎn)單的辦法就是稀釋。任何的樣品，不管是血樣還是尿樣，稀釋100倍以后，肯定沒(méi)有離子抑制了，內(nèi)標(biāo)的CV也會(huì)很穩(wěn)定。
把內(nèi)標(biāo)的CV盡量做的小的好處是什么呢？那就是能更好得看到其它的東西。打一個(gè)比方，坐在搖晃的車?yán)飳懽?，車搖晃的厲害了，寫的什么字就看不出來(lái)了。要想看清寫的字，就要把車的搖晃度給降下來(lái)。車開(kāi)得越穩(wěn)定，越能寫更小的字。內(nèi)標(biāo)的CV就像車的搖晃度，越小才能看見(jiàn)手的細(xì)微動(dòng)作。
CV降下來(lái)以后我們要看什么呢？看outlier，看內(nèi)標(biāo)太高或太低的點(diǎn)。如果絕大部分病人的內(nèi)標(biāo)都在平均值的上下10%以內(nèi)，那突然有一個(gè)點(diǎn)在20%，那這個(gè)點(diǎn)就是outlier。如果內(nèi)標(biāo)的CV在40%，那只有60%以外的點(diǎn)才能算outlier，就好像坐在走山路的車?yán)铮嶔さ锰珔柡?，只能寫大字了，只能看到很離譜的outlier了。
某個(gè)病人樣品里的內(nèi)標(biāo)太高或太低，成了與眾不同的outlier，這是個(gè)警告，這里面有很多信息，有很多原因。內(nèi)標(biāo)太高或太低時(shí)，測(cè)得的病人結(jié)果有可能是不準(zhǔn)的。直接把這樣的結(jié)果送出去是可能會(huì)對(duì)臨床產(chǎn)生負(fù)面影響的。內(nèi)標(biāo)outlier的成因可以大致分為兩類，一類是不可重復(fù)的，另一類是可重復(fù)的。不可重復(fù)的有很多原因。第一，內(nèi)標(biāo)加的體積不對(duì)，少了或多了。氣泡會(huì)導(dǎo)致少，tip外面多掛一滴會(huì)導(dǎo)致高。不小心加了兩次內(nèi)標(biāo)也會(huì)導(dǎo)致高。第二，樣品的體積不對(duì)。加少了會(huì)導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)高，加多了會(huì)導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)少。第三，進(jìn)樣量不對(duì)。加樣時(shí)要是混進(jìn)了個(gè)大氣泡，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)減少。這個(gè)有時(shí)可以從液相的壓力曲線上看的出來(lái)。第四，液相什么地方漏了，樣品有丟失。一般這種情況下，后面的所有的樣品的內(nèi)標(biāo)都低。以上這幾種情況都是不可重復(fù)的。一個(gè)方法既然已經(jīng)上臨床了，那表現(xiàn)肯定是不錯(cuò)的，在大部分的情況下，是不應(yīng)該出現(xiàn)上述的情況的。如果真的出現(xiàn)了，那重復(fù)一次還會(huì)同樣發(fā)生的幾率是小之又小。如果真是體積加錯(cuò)了，是能檢測(cè)出來(lái)的，有時(shí)肉眼都能看得出。如果再測(cè)一次，內(nèi)標(biāo)是好的，病人結(jié)果跟第一次一樣，那就有可能是LC進(jìn)樣時(shí)有了氣泡或者哪里漏了。如果第二次的結(jié)果跟第一次不一樣，那就再測(cè)一次，看能不能重復(fù)第二次的結(jié)果。如果可以，那就說(shuō)明第一次有可能是體積加錯(cuò)了。總之，這幾種原因?qū)е碌膬?nèi)標(biāo)升高或降低是不可重復(fù)的，再做一次可能就正常了。
如果再做一次，甚至再做兩三次，內(nèi)標(biāo)總是偏高或偏低呢？這就是樣品本身引起的了，是可以重復(fù)的。這里面又分為兩個(gè)原因，一個(gè)是離子抑制，也就是本節(jié)的主題，另外一個(gè)是干擾物。離子抑制也是由干擾物引起的，但這個(gè)干擾物是看不見(jiàn)的，峰的形狀沒(méi)有異常，只是峰面積小了。能看得見(jiàn)的"干擾物"是會(huì)把峰型給搞糟的，多了個(gè)峰肩或有拖尾。看的見(jiàn)的干擾物以后再說(shuō)，這里只講看不見(jiàn)的干擾物，也就是離子抑制。在這種情形下，病人的血液里有一種物質(zhì)，可以把內(nèi)標(biāo)的信號(hào)給抑制掉，這就是離子抑制。
離子抑制一般發(fā)生在離子化這一步。離子化是鏈接色譜和質(zhì)譜的關(guān)鍵步驟。離子化其實(shí)是和氣化幾乎同時(shí)發(fā)生的。這個(gè)過(guò)程就像一只水槍包括在一個(gè)通了電的吹風(fēng)機(jī)里。被檢測(cè)物和內(nèi)標(biāo)從水槍里出來(lái)，周圍夾裹著吹風(fēng)機(jī)里吹出的熱氣，附近還有高壓電。最后的結(jié)果是熱氣把液體蒸發(fā)了，高壓電把分子給離子化了。只有這樣，赤裸的帶電離子才能飛進(jìn)質(zhì)譜，被檢測(cè)到。
如果病人的樣品里有這么一種物質(zhì)，比如是一種藥物或藥物的代謝物，它正好和被檢測(cè)物同時(shí)從那液相里出來(lái)，同時(shí)被離子化。如果這種物質(zhì)的濃度夠高，那么它就會(huì)和被檢測(cè)物以及內(nèi)標(biāo)去爭(zhēng)搶離子。爭(zhēng)搶的結(jié)果就是被檢測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的離子化不完全，產(chǎn)生的離子少了，信號(hào)自然就弱了，就變成outlier了。而且這個(gè)outlier是可以重復(fù)的，因?yàn)槟莻€(gè)藥品存在在樣品里，測(cè)多少遍都是那個(gè)時(shí)候出來(lái)，跟被測(cè)物搶離子。
離子抑制怎樣確避免呢？樣品稀釋一下就可以做到。樣品稀釋以后，一塊兒出來(lái)的其它物質(zhì)就被稀釋掉了，但是內(nèi)標(biāo)加的還是一樣多。敵人少了，內(nèi)標(biāo)的濃度沒(méi)變，爭(zhēng)搶離子的戰(zhàn)斗就會(huì)偏向內(nèi)標(biāo)這一方。最后的結(jié)果就是內(nèi)標(biāo)的峰會(huì)升高（但不會(huì)高到跟平均值一樣的水平，因?yàn)閿橙酥皇菧p少了，并沒(méi)有消失），但是被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的比值不變。也就是測(cè)得的結(jié)果在考慮到稀釋的倍數(shù)以后是不變的。如果稀釋后是這樣的情形，內(nèi)標(biāo)向平均值靠攏，而且測(cè)得的結(jié)果不變，那內(nèi)標(biāo)減少的原因就是離子抑制。測(cè)得病人的結(jié)果是可以出具的。
在用稀釋來(lái)解決離子抑制的過(guò)程中，有個(gè)很有趣的現(xiàn)象，每次都能重復(fù)出現(xiàn)，那就是稀釋一倍以后的內(nèi)標(biāo)會(huì)好一些，但總達(dá)不到預(yù)期的水平。比如不稀釋的話，內(nèi)標(biāo)被抑制了50%，那稀釋一倍以后應(yīng)該是被抑制25%。但實(shí)際操作中往往是在30%左右，靠近黃金分割的那個(gè)比例，0.618。它離不稀釋的內(nèi)標(biāo)值的距離近一些，是4；離均值遠(yuǎn)一些，是6。這里面肯定有什么規(guī)律在里面，但是我還沒(méi)有找到令人信服的科學(xué)依據(jù)。我只能用一個(gè)生活中的例子來(lái)大概解釋一下：沒(méi)有離子抑制的樣品干凈，像牛奶；有離子抑制的樣品臟，像咖啡。把牛奶咖啡混在一起，顏色居中，但更偏向咖啡一些。就好像把一滴牛奶滴到咖啡里，咖啡還是咖啡的顏色；把一滴咖啡滴到牛奶里，牛奶就會(huì)有咖啡色。
在此總結(jié)一下本節(jié)的內(nèi)容：
1. 病人樣品里的某種物質(zhì)在離子化時(shí)跟被測(cè)物競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致信號(hào)降低，造成離子抑制。
2. 離子抑制是可重復(fù)的，與樣品制備無(wú)關(guān)。
3. 離子抑制是可以用稀釋法來(lái)消除的。
4. 離子抑制只有在特殊的情況下才有可能會(huì)造成定量的偏差。
能通過(guò)稀釋來(lái)解決的離子抑制還不叫"基質(zhì)效應(yīng)"；基質(zhì)效應(yīng)是稀釋解決不了的離子抑制。關(guān)鍵的關(guān)鍵，是用什么溶液做稀釋以及用什么溶液來(lái)配標(biāo)準(zhǔn)品。這個(gè)留到下一節(jié)來(lái)講。
聲明：本文章來(lái)源“臨床質(zhì)譜網(wǎng)”，作者：袁超博士，豪思生物已獲得臨床質(zhì)譜網(wǎng)和袁超博士授權(quán)，如需轉(zhuǎn)載，請(qǐng)聯(lián)系原作者！
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