編者導(dǎo)語
非常榮幸邀請到袁超博士做客“臨床質(zhì)譜網(wǎng)媒體平臺”。我們在“專家講壇”欄目中持續(xù)發(fā)布袁老師有關(guān)臨床質(zhì)譜的應(yīng)用、標(biāo)準(zhǔn)品、線性、權(quán)重、同位素內(nèi)標(biāo)、離子抑制、基質(zhì)效應(yīng)等精彩干貨內(nèi)容，以饗讀者。承接上期，本期袁老師為大家?guī)硗鈽?biāo)與定量法總結(jié)的精彩解讀。
作者簡介
袁超博士
現(xiàn)任美國華人臨床化學(xué)學(xué)會主席，美國大型臨床檢測實(shí)驗室質(zhì)譜實(shí)驗室主任。于四川大學(xué)獲得生物化學(xué)學(xué)士學(xué)位、美國堪薩斯大學(xué)獲得生物化學(xué)博士學(xué)位，其后在霍普金斯和伊利諾伊大學(xué)做博士后，主要研究方向為蛋白質(zhì)組和質(zhì)譜。袁超博士最近十年主要從事臨床質(zhì)譜方法開發(fā)和應(yīng)用。
第七節(jié) 外標(biāo)及定量方法總結(jié)
臨床質(zhì)譜這一系列文章是我兩年前的夏天寫的。后來因為種種原因，一直沒有再續(xù)。最近這些文章被《臨床質(zhì)譜檢測》的小編發(fā)現(xiàn)了，轉(zhuǎn)載了他們的推文里。在此我要感謝他的欣賞和讀者的捧場。希望大家有什么反饋和要求，都可以寫在留言里。
在跟這位小編接觸的過程中，我們做了一些學(xué)術(shù)性的探討，由此對以前的文章也做了些調(diào)整和修改。我們最近討論的一個話題是外標(biāo)法。小編提到了一些我忽略的知識點(diǎn)，所以我把外標(biāo)單獨(dú)寫了一節(jié)，另外把各種定量的方法總結(jié)一下。再次重申，都是我的一家之言，僅供大家做參考。你們?nèi)绻矚g如下的內(nèi)容，那要感謝這位小編約稿的熱情和對我的盲點(diǎn)的提醒。
從科技發(fā)展的歷史來看，內(nèi)標(biāo)要比外標(biāo)晚。所以應(yīng)該是先討論外標(biāo)，后討論內(nèi)標(biāo)。但因為是臨床質(zhì)譜的文章，外標(biāo)這個概念基本不涉及，所以在以前的章節(jié)里，一直也沒有提到外標(biāo)。那么我們現(xiàn)在就要沿著時間的長河逆流而上，回到還沒有液質(zhì)聯(lián)用的年代，看一看外標(biāo)的興起和衰落，以及殘存到現(xiàn)在的一些獨(dú)特用處。
什么是外標(biāo)？外標(biāo)就是獨(dú)立于病人樣品之外的標(biāo)準(zhǔn)品。而內(nèi)標(biāo)是加在病人樣品里面的標(biāo)準(zhǔn)品。在絕大多數(shù)的臨床檢測方法里，比如光吸收和免疫法，是不用內(nèi)標(biāo)的，所以外標(biāo)就是標(biāo)準(zhǔn)品，也沒有必要做出外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)的區(qū)分。就好像時區(qū)這個概念，在中美之間有不同的使用習(xí)慣。美國有好幾個時區(qū)，每次開電話會議都要確定到底是東部時間還是西部時間。中國就一個時區(qū)，沒有必要提醒大家開會是北京時間，說的話就顯得有點(diǎn)兒畫蛇添足。
外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)的并存和區(qū)別使用是在色譜法里最先開始的。色譜的外標(biāo)其實(shí)也是標(biāo)準(zhǔn)品。色譜方法可以加內(nèi)標(biāo)，也可以不加內(nèi)標(biāo)。如果不加內(nèi)標(biāo)，那就是純外標(biāo)的方法，這個才是我們溯流而上要尋找的老祖宗。在純外標(biāo)的色譜法里，外標(biāo)的濃度從低到高都有，上樣以后經(jīng)過色譜分離，然后流到檢測池，產(chǎn)生一個色譜峰。色譜峰的峰高或峰面積與濃度成正比，畫一條直線就是標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此可以去算出病人樣品的濃度（圖一）。早期算峰面積的方法很原始：把色譜峰打印在紙上，用剪刀把峰剪下來，然后放到天平上稱，用紙的重量代表峰面積。當(dāng)我們感慨當(dāng)年編程用手工在紙帶上打孔是多原始時，色譜其實(shí)也經(jīng)歷了類似的翻天覆地的變化。
圖一 外標(biāo)法定量示意圖
色譜方法進(jìn)化過程中的一個重要里程碑就是內(nèi)標(biāo)的引入。色譜是一條河，彎來彎曲有變數(shù)。內(nèi)標(biāo)可以模擬被測物的行為，讓定量更加準(zhǔn)確。所以在色譜法里，內(nèi)標(biāo)的用法和原理是和質(zhì)譜法一樣的（見上一節(jié)）。也是用被測物和內(nèi)標(biāo)的比值來定量（圖二）。但區(qū)別在內(nèi)標(biāo)的理化性質(zhì)。色譜的內(nèi)標(biāo)必須要能和被測物在保留時間上分開。所以色譜的內(nèi)標(biāo)不可能是穩(wěn)定同位素標(biāo)記的，而是一個類似物，比如加了個甲基或乙?；念愃莆铩＿@樣在樣品前處理時，基本能代表被測物的行為，在色譜洗脫時又能和被測物分開。色譜的內(nèi)標(biāo)一定不能是內(nèi)源性的。如果病人的樣品里有內(nèi)標(biāo)這種化合物，那方法就不穩(wěn)定了。有時候好不容易選了個不錯的內(nèi)標(biāo)，跟被測物類似，而且體內(nèi)也沒有，但沒過幾年，內(nèi)標(biāo)被FDA批準(zhǔn)了，變成藥了，這下有些人的血液里帶這個內(nèi)標(biāo)了，方法就需要重建了。
圖二 內(nèi)標(biāo)法定量示意圖
正是因為色譜法里引進(jìn)了內(nèi)標(biāo)這個概念，才把以前的標(biāo)準(zhǔn)品硬生生的的給改成了外標(biāo)。就好像反向柱的出現(xiàn)硬生生的把以前的色譜柱改成了正向柱。在反向柱出現(xiàn)以前，色譜柱都是正向的；在內(nèi)標(biāo)出現(xiàn)以前，外標(biāo)是叫標(biāo)準(zhǔn)品的。
液質(zhì)聯(lián)用又是一個大的技術(shù)飛躍。它結(jié)合了液相色譜的強(qiáng)大分離、純化功能和質(zhì)譜的無可比擬的靈敏度、特異性。軟電離讓這兩個技術(shù)無縫對接，優(yōu)勢倍增，得諾貝爾獎是實(shí)至名歸。在液質(zhì)聯(lián)用的方法里，同位素內(nèi)標(biāo)的使用相當(dāng)于如虎添翼，讓質(zhì)譜法一躍成為臨床檢驗里的金標(biāo)準(zhǔn)，定量的標(biāo)桿。講到同位素內(nèi)標(biāo)，我們才又順著歷史的長河回到了當(dāng)下，回到了大家都熟悉的定量方法。但是內(nèi)標(biāo)的討論并沒有完全結(jié)束。
有些復(fù)雜的方法，被測的物質(zhì)太多，比如新生兒篩查（簡稱新篩），我們不可能給每一個被測物找到一個對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)。這個時候一些理化性質(zhì)相似的被測物就要共享一個內(nèi)標(biāo)了，或者共享一條標(biāo)準(zhǔn)曲線了。這時候的定量就不是非常準(zhǔn)確了。但新篩的正常范圍和不正常范圍區(qū)別很大，定量上有些偏差不影響臨床的應(yīng)用。
新篩要是給每一個被測物做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線的話，這個難度非常大。很多標(biāo)準(zhǔn)品是買不到的。買到了，穩(wěn)定性、準(zhǔn)確的稱量都是個問題。所以新篩用了個不得已的簡單定量方法：被測物濃度等于被測物的峰面積除以內(nèi)標(biāo)的峰面積乘以內(nèi)標(biāo)的濃度。這里面有一個假設(shè)：內(nèi)標(biāo)的離子化程度和質(zhì)譜信號強(qiáng)弱是和被測物相當(dāng)?shù)?。注意是相?dāng)，不是相等。只要是相當(dāng)?shù)?，那么用此方法建立的正常值范圍就是可靠的。這樣的半定量方法在新篩上用得很普及，對臨床的貢獻(xiàn)是有目共睹的。
像新篩這樣完全用內(nèi)標(biāo)做定量的方法對內(nèi)標(biāo)的穩(wěn)定性有很高要求。如果時間長了內(nèi)標(biāo)有降解，那么做出來的結(jié)果就會偏高，就會出現(xiàn)假陽性，會有很不好的后果。如果因為過了保質(zhì)期要經(jīng)常去買內(nèi)標(biāo)，價錢貴不說，不同批次間的差別也會影響方法的穩(wěn)定性。內(nèi)標(biāo)買來以后，怎樣保持、延長它的穩(wěn)定性，這里面有很多竅門。經(jīng)過跟小編商量，考慮到可能有的商業(yè)利益沖突，決定還是不在這里透漏的為好。
在此總結(jié)一下如上討論過的定量方法。即用外標(biāo)，又用內(nèi)標(biāo)的方法定量最準(zhǔn)確，在色譜和質(zhì)譜里也最常見。穩(wěn)定同位素的內(nèi)標(biāo)只能用在質(zhì)譜里，色譜里的內(nèi)標(biāo)是類似物。類似物內(nèi)標(biāo)也可以用在質(zhì)譜方法里（比如幾個被測物共享一個內(nèi)標(biāo)，或共享一條標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況），但這種定量不能稱為全定量，但又比下面的半定量要好。所以我給它起了個名字叫，叫四分之三定量（共享一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意，只有個別廠家的軟件允許共享標(biāo)準(zhǔn)曲線）和八分之七定量（共享一個內(nèi)標(biāo)，但是有各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。大家可以自己在實(shí)驗室試一下，把被測物的內(nèi)標(biāo)在軟件里互換一下，比如維生素D3的內(nèi)標(biāo)換給維生素D2用。標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控的結(jié)果都會差一些）。只用外標(biāo)，不用內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜方法是老方法，已經(jīng)被歷史所淘汰；只用外標(biāo)，不用內(nèi)標(biāo)的色譜方法還存在，它們被歷史拋棄只是時間問題。只用內(nèi)標(biāo)，不用外標(biāo)的質(zhì)譜定量方法只是用在個別的項目中，尤其是新篩的項目。在其它領(lǐng)域的應(yīng)用還在探索過程中。對這種定量方法的普遍了解、認(rèn)可、和接受還沒有到來。這樣的方法因為沒有標(biāo)準(zhǔn)曲線，所以不是真正意義上的定量方法，只能叫半定量。這樣的方法在不同實(shí)驗室之間是沒有辦法比較定量的，只能比較定性的結(jié)果。
這一節(jié)的技術(shù)討論到此為止，最后跟大家分享一個我自己親歷的小故事。小時候我就是個文學(xué)青年，喜歡讀小說，也喜歡寫點(diǎn)兒東西。看故事看到感人的地方，會情不自禁，淚如雨下。成年以后，心理成熟的多了，也就不那么觸景生情了。后來接觸了醫(yī)療服務(wù)這一行，見多了生死，解剖過尸體，心也就更硬了。但那天不經(jīng)意的看到一份兒病歷，里面夾了一封信，一行一行讀下來，不禁潸然淚下。這是一名護(hù)士寫的臨終記錄，記錄了一名新生兒的最后時光。專業(yè)的白描敘事里，讓人如臨其境，好像能看見撒在病床上的陽光，能聽見靜脈輸液的滴答聲，不禁感嘆生命的脆弱和人性的溫暖。那時自己初為人父，更能感同身受，理解做父母喪子的切膚之痛。于傷心處，不忍卒讀，掩卷幾次，方才讀完。我無法重復(fù)護(hù)士的原話，法律不允許，道德也不允許。新生兒到生命的最后也沒有個名字，就叫baby girl。就是這個baby girl和她的家人，對我們的新篩方法做出了巨大的、無可比擬的貢獻(xiàn)，讓我們可以一直有一個可靠的、穩(wěn)定的方法去造福其他病人。我要深深感謝這個baby girl， 也深深感謝她的家人。
聲明：本文章來源“臨床質(zhì)譜網(wǎng)”，作者：袁超博士，豪思生物已獲得臨床質(zhì)譜網(wǎng)和袁超博士授權(quán)，如需轉(zhuǎn)載，請聯(lián)系原作者！
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