編者導語
首先，非常榮幸的邀請到袁超博士做客“臨床質(zhì)譜網(wǎng)媒體平臺”。為了答謝業(yè)內(nèi)同行的厚愛，我們將會在“專家講壇”欄目中持續(xù)發(fā)布袁老師有關臨床質(zhì)譜的應用、標準品、線性、權重、同位素內(nèi)標、離子抑制、基質(zhì)效應等精彩干貨內(nèi)容，以饗讀者。承接上期，本期袁老師為大家?guī)硗凰貎?nèi)標的精彩介紹。
作者簡介
袁超博士
現(xiàn)任美國華人臨床化學學會主席，美國大型臨床檢測實驗室質(zhì)譜實驗室主任。于四川大學獲得生物化學學士學位、美國堪薩斯大學獲得生物化學博士學位，其后在霍普金斯和伊利諾伊大學做博士后，主要研究方向為蛋白質(zhì)組和質(zhì)譜。袁超博士最近十年主要從事臨床質(zhì)譜方法開發(fā)和應用。
第六節(jié) 同位素內(nèi)標
同位素內(nèi)標是質(zhì)譜方法獨有的，沒有別的臨床檢測方法用到同位素內(nèi)標。比如光吸收和免疫的方法，都無法分辨出被檢測物和同位素內(nèi)標的區(qū)別，因為它們的理化性質(zhì)太接近了。如果真的加進內(nèi)標，那測出來的值肯定大大的偏高。只有質(zhì)譜才能把同位素內(nèi)標和要檢測的物質(zhì)分得開，雖然它們的差別只有幾個道爾頓。
有一句古老的諺語叫"你不可能兩次趟過同一條河流，因為你第二次過河的時候，河里的水已經(jīng)跟上一次不一樣了"。液相色譜也是一條河，先從溶液瓶流到色譜泵，壓力增加后推著樣品到色譜柱子，在柱子里實現(xiàn)色譜分離后，不要的分流到廢液，有用的流向質(zhì)譜，最后在spray里氣化、離子化，鉆進質(zhì)譜。這中間就像彎彎曲曲的河道一樣，充滿了變數(shù)，同一個樣品做多遍，每遍得到的最后結果，不管是色譜峰的峰高還是峰面積，可能會有很大差別。色譜只是一條河，樣品的前期處理又是一條河。沉淀，離心，稀釋，復溶都存在變數(shù)。怎樣保證樣品里被檢測的物質(zhì)在經(jīng)過這一條一條的河以后，每次都以差不多的面目飛進質(zhì)譜呢？內(nèi)標是一個主要因素。
現(xiàn)在的內(nèi)標基本都是穩(wěn)定同位素標記的，最常見的是氘和碳十三。內(nèi)標用在質(zhì)譜上是上個世紀五六十年代的事兒，那時候這個新技術叫"同位素稀釋法"。這個名字古老的就像"學部委員"一樣，現(xiàn)在再沒人使用了。把這個詞掛在嘴邊的都是些八九十的老頭子。但那時候同位素內(nèi)標可是個新鮮概念，人們借用了漁民的術語來描述它的用處。漁民們每年要估計湖里魚的產(chǎn)量，然后根據(jù)產(chǎn)量來定捕撈量。怎樣精確的定量湖里有多少魚呢？這個就像怎樣準確測量血液里的分子濃度，總不能跳進去，一條一條的數(shù)吧。如果把湖抽干，然后再數(shù)?？蛇@與初衷事與愿違。所以漁民們發(fā)明了一個聰明的辦法。他們先抓一千條魚，每個魚的背上做個記號，穿個小鐵環(huán)，然后把這些做了記號的魚再放回湖里。過幾天，再捕一千條魚，然后看這些魚里面有多少條是有記號的。然后公式一算，就能估摸出湖里有多少條魚，帶標記的魚越少，湖里的魚越多。把有記號的魚放回湖里，稀釋到廣大的沒有記號的魚群里，這就是"同位素稀釋法"名字的由來。
同位素內(nèi)標和被檢測物是同一個物質(zhì)，但是其中的幾個氫原子被氘所取代，或者是碳十二換成了碳十三，理化性質(zhì)基本不變。即便是背上多了個這么個"金屬環(huán)"，"魚"該怎么游還是怎么游，不管游過幾條河，幾道彎，始終能代表著沒有標記的魚。如果河拐彎兒時，丟了幾條魚，那有標記的也會丟幾條，最終的比例是大致固定的。到了質(zhì)譜檢測的時候，有標記的沒標記的分子會被分開來算。質(zhì)譜就是一個能檢測分子量的精細的秤，幾個道爾頓的差別可以分得清清楚楚。標記了的魚放一堆兒，沒標記的一堆兒。然后算比例來決定濃度。如此這樣，漂流時所經(jīng)歷的變數(shù)都被內(nèi)標的此消彼消，此長彼長給扯平了。
所以內(nèi)標要跟被檢測的物質(zhì)是同一條"魚"。不能你要算鯽魚，卻放了背上有環(huán)兒的鯰魚進去。鯰魚在湖底里游，不可能代表鯽魚的行為，測出的數(shù)值會有偏差。但有時候市場上沒有帶環(huán)的鯽魚賣，只能用別的魚，如此的方法就不是很牢靠。其中一個表象就是稀釋時測不準。稀釋兩倍，濃度應該減半，可是用"鯰魚"的方法濃度不一定是一半，可能多，可能少。這種方法用起來要小心，市場上有賣鯽魚內(nèi)標時趕快換。
同樣是標記，碳十三就比氘要好。氘好比是一個大鐵環(huán)，標記上以后游的還是跟別魚有些許差別。過反相色譜柱時，出的峰總是要早一些，因為氘的親水性比氫要強。但是氘要比碳十三便宜很多。它是核電站冷卻水的副產(chǎn)品，或者說是廢料里提出來的，稍加分離就純化出氘來了。絕大多數(shù)氘做的內(nèi)標性能是很好的。出問題的經(jīng)常是一些疏水性比較差，保留時間比較短的物質(zhì)。出峰的時候跟很多其它物質(zhì)一起出來，些許的偏差就能引起濃度測不準。氘標記在分子結構上的何處也很有講究。有些化學基團，比如羥基，可以和溶液里的氫發(fā)生"氫氘交換"，魚的環(huán)兒丟了，那肯定就測不準了。一個補救方式是把內(nèi)標放在氘做的溶液里，這樣能保證"環(huán)兒"在用以前不丟。加到樣品里到上樣的時間很短，氫氘交換還來不及發(fā)生。但最好是把氘放到分子結構里不容易被交換的地方，比如苯環(huán)上，這樣用起來方便、省心。
如果氘是個大鐵環(huán)，碳十三就是個小塑料環(huán)了，對魚的改變可以忽略不計。但是代價是碳十三比較貴，還不一定每一種碳十三標記的魚都有。但近幾年碳十三的內(nèi)標越來越多。用的人多了，產(chǎn)量大了，價格就下來了。再說質(zhì)譜這么靈敏的方法，內(nèi)標只用一點點，經(jīng)常是買的一小瓶還沒用完呢，已經(jīng)到保質(zhì)期了。用量大的客戶往往可以影響供應商。所謂店大欺客，客大欺店。需求大了，就可以讓店家定制需要的"魚"。小店就只能買市面上有的魚。又一個例子證明只有大規(guī)模才能玩質(zhì)譜，要不然耗材的成本太高。
加幾個同位素（環(huán)）合適呢？一個兩個太少，會被未標記物的同位素峰所干擾。臨床質(zhì)譜測的物質(zhì)一般都在一千個道爾頓以內(nèi)，加一加二的同位素峰有個百分之一二，但加三的峰基本就看不見了。所以加三個同位素最好。氘加到六個會嚴重影響保留時間，強烈不建議。碳十三不改變疏水性，加上六七個也無所為。但加多了，價錢就上去 。
有了合適的同位素內(nèi)標后，每個樣品里要加多少呢？這里沒有一個標準的答案。內(nèi)標的濃度不能太高，太高費錢，還抑制沒有標記的魚；也不能太低，太低測出來的variation太大。我的經(jīng)驗是標準曲線最上端的三分之一，取個好配的整數(shù)。另外一個經(jīng)驗是取病人的濃度的中間值。把內(nèi)標配到這個濃度。這個濃度不是內(nèi)標本身的濃度，是加到樣品里后稀釋過后的濃度。當然也有例外，有些物質(zhì)的濃度太低，內(nèi)標也是那個濃度的話variation太大；或者因為內(nèi)標斷裂產(chǎn)生的碎片太弱，必須加的過量，才能達到和未標記物一樣的峰強度。一般這個時候斷裂的鍵正好在氘附近，可以丟氫，也可以丟氘。丟氘的當然特異性高，但是這樣的碎片比較少，信號弱，需要加的量多一些。最終目標是內(nèi)標的峰高和正常病人的檢測物的峰高差不多。但實際工作中，內(nèi)標的濃度有時要大得多。這種一般是被檢測物濃度太低，多加些內(nèi)標起保護作用。如果樣品制備中有丟失（比如被器皿吸附走了），那丟失的大多是內(nèi)標，被檢測物丟的少。這時候的內(nèi)標雖然比檢測物的濃度高很多，但還沒有高到在離子化時抑制別的分子的地步。
前面涉及了在質(zhì)譜里碰撞后產(chǎn)生的碎片的選擇。這是一個很值得討論的話題。不是峰最高的碎片就是最好的。碎片的特異性高更重要。建方法的時候多開幾個通道，包括三到四個碎片，看哪一碎片特異性最好。做一批不加內(nèi)標的病人樣品，看哪一個內(nèi)標的碎片最干凈，就選用哪一個。如果都不錯，那就選一個跟未標記物碎片的化學結構式等同的碎片。最好是這個碎片上也還帶的有內(nèi)標，哪怕只有一個氘，也可和未標記物的碎片分離開。這樣在質(zhì)譜的collision cell里做碰撞時，因為碎片相同所產(chǎn)生的殘余干擾可以消除。
內(nèi)標要盡早的加，最好是加完病人樣品立刻加。能不能先加內(nèi)標，再加病人樣品呢？沒有說不行，但這樣做總覺得怪怪的。有時內(nèi)標還不能加太早，比如要做dialysis的樣品，加的早會影響dialysis的平衡。內(nèi)標的濃度上面有討論。內(nèi)標的體積最好在100微升以上。太小的體積加起來variation大。當然有例外。如果做蛋白沉淀前用了太多的水溶的內(nèi)標，有機溶劑的體積會很大，操作起來不方便。如果可能的話，可以把內(nèi)標直接加到有機溶劑里，這樣加內(nèi)標和沉淀這兩步可以變做一步。加的體積大一些，也好操作，除非內(nèi)標在有機溶劑里不溶或不穩(wěn)定。
每一個病人的樣品里加了同樣的體積，同樣的濃度的內(nèi)標，但是最后檢測出來的內(nèi)標的峰卻不盡一樣。除了一條河無法過兩次外，基質(zhì)效應也是一個重要因素。后續(xù)會有專門章節(jié)說一說基質(zhì)效應。
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