編者導(dǎo)語
首先，非常榮幸的邀請到袁超博士做客“臨床質(zhì)譜網(wǎng)媒體平臺”。為了答謝業(yè)內(nèi)同行的厚愛，我們將會在“專家講壇”欄目中持續(xù)發(fā)布袁老師有關(guān)臨床質(zhì)譜的應(yīng)用、標(biāo)準(zhǔn)品、線性、權(quán)重、同位素內(nèi)標(biāo)、離子抑制、基質(zhì)效應(yīng)等精彩干貨內(nèi)容，以饗讀者。承接上期，本期袁老師為大家?guī)順?biāo)準(zhǔn)曲線中權(quán)重的精彩介紹。
作者簡介
袁超博士
現(xiàn)任美國華人臨床化學(xué)學(xué)會主席，美國大型臨床檢測實驗室質(zhì)譜實驗室主任。于四川大學(xué)獲得生物化學(xué)學(xué)士學(xué)位、美國堪薩斯大學(xué)獲得生物化學(xué)博士學(xué)位，其后在霍普金斯和伊利諾伊大學(xué)做博士后，主要研究方向為蛋白質(zhì)組和質(zhì)譜。袁超博士最近十年主要從事臨床質(zhì)譜方法開發(fā)和應(yīng)用。
第五節(jié) 妥協(xié)的藝術(shù)-權(quán)重
理想的情況下，所有標(biāo)準(zhǔn)品的點都在一條直線上。但現(xiàn)實情況往往不會這么完美。就像要修一條高鐵，靠近了這個城市，就可能疏遠了那個城市。每個點都想高鐵從我這里過。怎么取舍，怎樣選擇，這就是妥協(xié)的藝術(shù)。
既然不能滿足所有人，那就把大家的不滿足的總和做到最小就行了。對于標(biāo)準(zhǔn)曲線來說，這個方法就叫線性回歸（linear regression，點到線的垂直距離)。實際生活中用的更多的是Deming Regression（點到線的直線距離）。如果你對X的測量很有信心，那就用前者；如果X和Y的測量都沒有百分百的把握，就用后者。
目前為止，我們對每個點都是一視同仁的。好比公司食堂每周的菜譜，每個人都有投票權(quán)，這叫民主。但是公司業(yè)務(wù)上的決定就不能這樣了。明年上馬什么項目是不會過問保安和保潔的。這時候領(lǐng)導(dǎo)的意見就占上風(fēng)了，所謂"位高權(quán)重"和"人微言輕"。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，這個還真翻譯成了權(quán)重（weighing factor）。常見的權(quán)重是1/X。就好比投票的時候，你的票要乘以一個系數(shù)，這個系數(shù)可以是你的工資，也可以是你管理的人的數(shù)目。這樣領(lǐng)導(dǎo)的權(quán)重就顯出來了。反應(yīng)在政治生活里，就是社會的精英階層決定社會的走向。在臨床檢測中，這樣做也是有意義的。比如你的曲線是從濃度1個單位到100個單位。那么1個單位的偏差對于1來說就是50%，但對于100來說就只有1%。所以劃線的時候當(dāng)然要照顧濃度低的點，上面的點偏個十個八個單位，也關(guān)系不大。1/X權(quán)重的意思就是每個點到線的距離要乘以1/X、再加和、然后取最小值。如果總統(tǒng)選舉也可以加權(quán)重（選票乘以你過去四年交的聯(lián)邦稅），那些靠吃救濟吃飯不交稅的窮人就沒有發(fā)言權(quán)了，民主黨也就沒戲了。所以政治是最能體現(xiàn)妥協(xié)的活動。參政兩院的體制就是個典型。每個州有兩名參議員的名額，眾議員的人數(shù)則按你本州的人數(shù)多寡決定。一個加權(quán)，一個不加權(quán)。重大事項必須在參眾兩院都通過才行。這樣既照顧了小州，又照顧了大州，這就是妥協(xié)?，F(xiàn)在人人都有投票權(quán)，200年前黑奴是沒有投票權(quán)。有一陣兒，一個黑人有3/5張選票。這也是南方州和北方州的妥協(xié)。因為如果不妥協(xié)，那就是戰(zhàn)爭。與其戰(zhàn)爭，還不如妥協(xié)。
另一個常見的權(quán)重就是1/X2。這樣的話每張選票就不是乘以所得稅了，而是乘以所得稅的平方。這樣富人就有更大的決定權(quán)了。在政治生活里，這個叫寡頭，國家的命運決定在少數(shù)人手里。最極端的情況是由一個點來決定曲線的走向，這個叫獨裁。1/X2權(quán)重反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，就是低濃度的點更有決定性。這個在臨床檢測上是有意義的。大多數(shù)的指標(biāo)都是低的是好，高的不健康。標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍往往涵蓋了正常人和病人的常見值。而正常人往往在這個范圍的低端。臨床檢測最重要的是能把高的正常的值和低的病人的值分開，至于很高的值，測的準(zhǔn)不準(zhǔn)已經(jīng)不重要了。好比空腹葡萄糖的100 mg/dL和125 mg/dL有很大區(qū)別，一個是正常、一個是糖尿??；但200和250就沒有臨床意義了。
1/X和1/X2，哪一個更好呢？這是一個困擾了我很久的問題。以前選1/X2是理所當(dāng)然的，因為有專門的文章論述講1/X2為什么更好。我也就從來沒有試過1/X的權(quán)重。換了單位以后，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的權(quán)重基本上都是1/X。人越老，越?jīng)]有志氣。改造世界的勇氣越來越小，改變自己適應(yīng)環(huán)境的能力越來越強。單位這么大，牛人這么多，用1/X肯定有道理。收起自己的疑問，慢慢觀察。發(fā)現(xiàn)除了權(quán)重，還有好多跟以前不一樣的地方。這些不同漸漸開始發(fā)生了關(guān)聯(lián)，變得有道理起來，最后幫助自己從不同的角度來認(rèn)識這個行業(yè)，這個社會。
1/X2是建立在低濃度能測的很準(zhǔn)的基礎(chǔ)上了。你給了低濃度那么大的權(quán)重，如果測不準(zhǔn)，那影響豈不是太大。怎樣知道低濃度是不是測的準(zhǔn)呢？答案要從實踐中得來。把所有濃度的標(biāo)準(zhǔn)品測十次，算平均值和方差，再算CV。如果CV從高濃度到低濃度都在5%以內(nèi)，那低濃度給個1/X2的權(quán)重是可以的。但如果高濃度的CV不錯，但低濃度的CV接近10%了，那低濃度就不能給它1/X2的權(quán)重了。好比拍腦門一天一個主意的領(lǐng)導(dǎo)的話，不能太當(dāng)回事。即便低濃度的CV在5%以內(nèi)，我的建議還是用1/X。這個5%是在一天內(nèi)取得的。如果不同的人在不同的日子里做，就不一定能達到了。如果真能達到，那你的方法就是好的過頭了，需要把它人為的降一降，以節(jié)省成本。比如用的量變小一些，本來用200微升血樣的，試試100微升；本來進樣80微升的，試試40微升。進的樣品量少，對儀器的污染就小，儀器使用的時間就更長；另外殘留也會少，可以減少重復(fù)率。最終的目的都是降低成本。
低濃度的重復(fù)性差是允許的。CLSI里就有這樣的論述。標(biāo)準(zhǔn)品的測得值和規(guī)定值之間的差別可以在低濃度時放開一些，別的點是15%，最低的點可以是20%。由于低濃度的點測的不是很穩(wěn)定，所以不能給1/X2的權(quán)重，1/X是恰如其分的。為什么？有幾個原因。1）醫(yī)院是不會把整管血給公司的；它自己要留一些做其它檢測項目。所以我們拿到的樣品的體積要比醫(yī)院小。不是每個樣品都少。但是我們的方法要盡量照顧體積小的樣品（又是權(quán)重），所以同樣的檢測方法，我們用的樣品量要少。量少，這就會影響靈敏度，尤其是低端的靈敏度；2）公司的儀器更老，靈敏度更低。一般儀器的壽命是7年。醫(yī)院財大氣粗，買新儀器不眨眼睛。公司里超過10年的老儀器比比皆是。3）公司的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍更寬，一般都到99%了。寬的好處是涵蓋的范圍大，超出這個范圍的樣品就會很少。所以公司用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的低濃度更低，高濃度更高。這可以減少樣品的重復(fù)率（超出線性范圍的樣品，需要稀釋后再測），最終目的是減少成本?？傊痪湓挘纠镆酶畹膬x器，更少的樣品，把更低的濃度測出來。聽起來好像很困難。但也不是做不到。具體的方法有很多，不是都能說的。1/X是能說的一個。用了1/X，我們就不倚重最低的點了，中濃度的點還是測的準(zhǔn)，靠的住的。公司里樣品量巨大，所以標(biāo)準(zhǔn)品可以用好幾個濃度的。醫(yī)院的量少。一天就20個樣品，放上11個標(biāo)準(zhǔn)品就顯得頭大身子小了。一般都是5個點，所以每個點都重要。兩點總是一條直線；三個點誰也說服不了另外兩個；四個點可以兩兩作對；只有到了五個點，才能做到民主，協(xié)商，妥協(xié)，共贏。公司里每天成百上千的量，放11個點做曲線不在話下。在這11個點中，最被看重的是中間的7 個點。這七個點是中流砥柱。他們基本決定了標(biāo)準(zhǔn)曲線的走向。但凡有一個反骨，直接去掉就行了。這樣畫出來的曲線，延伸到低端也能保證是基本正確的。更何況公司的曲線低端已經(jīng)低到?jīng)]有臨床意義了，放在那兒就是個擺設(shè)。最是擺設(shè)的應(yīng)該是濃度為零的那個點。正常情況下是用不上的。如果它有讀數(shù)了，那說明某種溶液被污染了。這個點好比總統(tǒng)的替身；他沒事兒，就沒他的事兒；他有事兒，那就是出大事兒了。
從上可以看出商業(yè)和醫(yī)院實驗室的區(qū)別。商業(yè)實驗室是追求效率和效益的：在滿足質(zhì)量的前提下，怎么省錢怎么做；醫(yī)院是直接服務(wù)臨床的：精益求精，沒有最好，只有更好，關(guān)鍵是讓醫(yī)生高興。有時候好到過分的地步了。好比是跳高比賽，公司的目的是只要能過桿兒就行，再高就是浪費體力；醫(yī)院是要做到比別人更高、更快、更強。如果50以下都是正常，公司就會覺得能把10和15區(qū)分開是就一種浪費。好比一個子彈打死一個敵人是好，三個子彈打死一個敵人就是浪費。我天天琢磨的就是怎么能一個子彈打死仨敵人。
說到權(quán)重，那就把另外幾個跟標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)的參數(shù)也討論一下吧。首先是過不過原點。一般情況下是不過的。過的話，低濃度點的偏差會太大。其中一個原因是本底。沒有任何物質(zhì)的濃度會絕對是零的。比如尼古丁，只要你的方法夠靈敏，它是無處不在的。有了本底，標(biāo)準(zhǔn)曲線就無法過零點，強制過零點是會出麻煩的。
特殊情況下是可以過原點的，比如只有一個標(biāo)準(zhǔn)品的時候。這個標(biāo)準(zhǔn)品和原點連一條線就是標(biāo)準(zhǔn)曲線。這樣做在質(zhì)譜里非常少見，但在純色譜方法里倒是很常見。我覺得原因有四。其一是色譜法多是很多年前建的老方法。那時候沒這么多講究，怎么簡單怎么來。其二是老方法都很長，20-30分鐘的很常見。這樣的話標(biāo)準(zhǔn)品多了，樣品做到下班也做不完，對服務(wù)臨床不利。第三，光吸收做定量的線性非常好，不管是向下延伸還是向上延伸，因為它不像質(zhì)譜，有離子化這么個不太有重復(fù)性的步驟。第四個就是色譜方法特有的，叫歸零，這個在質(zhì)譜上做不到。就好像打算盤，會的都是老人家，年輕人都不會。歸零就是在檢測方法的最開始強制的把那個時候的光吸收值定為零。這樣的話，即便有本底，也都給歸零、看不出了。目前為止，還沒有哪一家的質(zhì)譜生產(chǎn)商能做出自動歸零的軟件。一個標(biāo)準(zhǔn)品加上原點，那就沒有權(quán)重什么事兒了，因為怎么畫都是兩點一線。自動歸零延伸出另外一個更神奇的東西，那就是流動相可以循環(huán)使用！每天不用配流動相了。流動相從柱子流出去，經(jīng)過光吸收的檢測池，又流回到了裝流動相的瓶子里！我第一次看到的時候簡直不敢相信自己的眼睛，這個老古董的方法真的好有創(chuàng)意啊！因為有自動歸零，所以流動相被污染了也可以用。另外，色譜法很多是等梯度洗脫的，只有一瓶流動相，所以可以重復(fù)使用，唯一不好的是方法的時間太長。第三，老方法的樣品前處理很復(fù)雜，處理完的樣品非常干凈，不會有太大污染。現(xiàn)在的色譜儀更先進了，可以把出峰的那一段兒分到廢液里，其它相對干凈的還是流回到原瓶，這樣樣品就不用處理的那么干凈，或者流動相重復(fù)使用的次數(shù)更多一些。
還有一個有意思的話題是標(biāo)準(zhǔn)曲線到底是直線還是曲線。顧名思義，應(yīng)該是條曲線，可偏偏大部分情況下，它是條直線。有沒有彎的標(biāo)準(zhǔn)曲線呢？有。
質(zhì)譜的線性范圍一般在3.5個數(shù)量級左右，也就是說最高和最低大概差個幾千倍。這個在臨床上夠用了，很少有那個被測物在不同人的體內(nèi)能差一萬倍的。但是，凡事都有例外。一是人為的沒經(jīng)驗，為了追求靈敏度，樣品用的量太大，超出了質(zhì)譜的線性范圍，在高濃度的時候，濃度還在往上走，但是質(zhì)譜儀的信號飽和了。電噴霧的時候，沒有再多的離子可以給你了，濃度再高，信號也上不去了，這時候的標(biāo)準(zhǔn)曲線就要彎了，向下彎。還有更甚之的是連色譜都飽和了，出的峰不但高，而且頭是平的，還有fronting。第二種情況比較特殊，是離子化的協(xié)同效應(yīng)，也就是1加1要大于二。在被測物的濃度升高的時候，離子化有疊加的效應(yīng)。這樣濃度升高時，標(biāo)準(zhǔn)曲線也會彎，但是是反方向的彎，向上彎。還有一種解釋是吸附作用。濃度低的時候，被測物被容器吸附了。濃度增高時，被吸附的相對減少，信號增加的比濃度更快，所以向上彎了。第三種情況是有多個被測物存在的情況下，為了照顧那個信號最低的，把信號高的被測物頂?shù)劫|(zhì)譜的線性范圍以外了。這個時候的解決辦法就是要人為的降一降那個信號好的，比如用個豐度低的離子，或者把Q2的碰撞能量加一加，等等。最終目的是讓大家齊頭并進，都控制在質(zhì)譜的線性范圍內(nèi)，因為標(biāo)準(zhǔn)曲線還是直的好。
聲明：本文章來源“臨床質(zhì)譜網(wǎng)”，作者：袁超博士，豪思生物已獲得臨床質(zhì)譜網(wǎng)和袁超博士授權(quán)，如需轉(zhuǎn)載，請聯(lián)系原作者！
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