編者導(dǎo)語
首先，非常榮幸的邀請(qǐng)到袁超博士做客“臨床質(zhì)譜網(wǎng)媒體平臺(tái)”。為了答謝業(yè)內(nèi)同行的厚愛，我們將會(huì)在“專家講壇”欄目中持續(xù)發(fā)布袁老師有關(guān)臨床質(zhì)譜的應(yīng)用、標(biāo)準(zhǔn)品、線性、權(quán)重、同位素內(nèi)標(biāo)、離子抑制、基質(zhì)效應(yīng)等精彩干貨內(nèi)容，以饗讀者。承接上期，本期袁老師為大家?guī)砼R床分析中最核心的部分標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線的精彩介紹。
作者簡介
袁超博士
現(xiàn)任美國華人臨床化學(xué)學(xué)會(huì)主席，美國大型臨床檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)室主任。于四川大學(xué)獲得生物化學(xué)學(xué)士學(xué)位、美國堪薩斯大學(xué)獲得生物化學(xué)博士學(xué)位，其后在霍普金斯和伊利諾伊大學(xué)做博士后，主要研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)組和質(zhì)譜。袁超博士最近十年主要從事臨床質(zhì)譜方法開發(fā)和應(yīng)用。
第四節(jié) 標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)準(zhǔn)曲線
任何知識(shí)都不是孤立的，就像房頂?shù)耐撸黄瑝褐黄?。想要揭開其中的一片，往往要先揭開旁邊的幾塊兒。如此類推，往往不知應(yīng)該從哪兒開始下手。想來想去，決定單刀直入，選取最核心的一塊瓦，標(biāo)準(zhǔn)品。
臨床檢測的數(shù)據(jù)要想測的準(zhǔn)，離不開一條好的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通俗來講，標(biāo)準(zhǔn)曲線就像一把尺子。只有把尺子做準(zhǔn)確了，才能把未知物品的長度測準(zhǔn)確。從科學(xué)上來講，標(biāo)準(zhǔn)曲線就是檢測物質(zhì)的濃度和儀器讀數(shù)的一種線形關(guān)系。一般是濃度越高，讀數(shù)越大。標(biāo)準(zhǔn)品的濃度是已知的，高中低都有。測完標(biāo)準(zhǔn)品以后，把它們的濃度和儀器測得的讀數(shù)在x/y的坐標(biāo)紙上一畫，連一條線就成了。測未知的病人樣品時(shí)，濃度（x)是未知的，只有儀器的讀數(shù)(y)，通過這條曲線可以把y換算成濃度。
標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)該怎么做，怎么用，這里面有很多學(xué)問。質(zhì)譜是新鮮技術(shù)，大多的檢測項(xiàng)目還買不到標(biāo)準(zhǔn)品，只能自己配。做標(biāo)準(zhǔn)品需要有純樣品。最好的純樣品應(yīng)該是濃度和純度都有保證書的，這樣用起來放心。如果是液體的溶液就更好了，省去自己稱量和溶解的麻煩。高濃度的純樣品要稀釋到不同的低濃度才能使用。用什么來稀釋是下一個(gè)非常關(guān)鍵的步驟，這里面牽扯到基質(zhì)效應(yīng)。這個(gè)留作以后再討論，因?yàn)榛|(zhì)效應(yīng)這塊兒瓦是質(zhì)譜臨床應(yīng)用里比較難理解的一個(gè)概念。
標(biāo)準(zhǔn)品的濃度范圍怎么定，最高定多高，最低定多低？這個(gè)要根據(jù)臨床的需要和實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況來定。一般的情況下是標(biāo)準(zhǔn)曲線要覆蓋95%病人樣品的濃度，最好是能覆蓋99%的病人。這樣只有1%的病人濃度在標(biāo)準(zhǔn)品范圍之外。濃度太高的病人樣品需要稀釋后重做才能出報(bào)告的。所以標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍大的好處是降低重復(fù)率。重復(fù)率對(duì)病人、對(duì)實(shí)驗(yàn)室都是一個(gè)壞事情。對(duì)病人來說，延遲了得到結(jié)果的時(shí)間，對(duì)實(shí)驗(yàn)室來說增加了開支。那么可不可以把超過標(biāo)準(zhǔn)品范圍的濃度直接出報(bào)告，不做稀釋呢？答案是可以的，但有限制條件。最高可以超出最高點(diǎn)的50%，最低可以比最低標(biāo)準(zhǔn)品低50%。為什么是50%呢？沒有道理，是行業(yè)共識(shí)。這樣做的代價(jià)是什么呢？是每半年要做一次線性范圍的驗(yàn)證。線性范圍的驗(yàn)證留到以后再講，反正每半年需要做這么一次試驗(yàn)，還挺麻煩的。為什么是半年呢？又是行業(yè)共識(shí)。以后還會(huì)遇到很多的行業(yè)共識(shí)的東西，我就不一一點(diǎn)出來了。要想不麻煩，那就把標(biāo)準(zhǔn)品范圍做寬，做得和線性范圍一樣寬，這樣就不用每半年做一次驗(yàn)證了。但下一個(gè)限制條件就又來了，最高的濃度總不能超過純品的濃度吧？另外濃度高了，用的純品也就多了，價(jià)格也就上去了。所以最后濃度范圍的選定是根據(jù)多方面的因素綜合選定的。
有了最高和最低的濃度，中間的怎么辦呢？放幾個(gè)點(diǎn)，濃度定在哪里？定幾個(gè)點(diǎn)要看最高和最低的濃度的差異，相差越大，點(diǎn)數(shù)越多，一般差一個(gè)數(shù)量級(jí)放要三個(gè)點(diǎn)。總數(shù)一般都是奇數(shù)，比如五個(gè)、七個(gè)、九個(gè)，就像政治局常委和聯(lián)邦最高法官的數(shù)目，表決的時(shí)候不會(huì)騎墻。中間點(diǎn)的濃度既要照顧臨床的需要，有要便于配置。臨床上有病沒病的臨界點(diǎn)附近要放一個(gè)點(diǎn)；濃度最好是等差等比的梯度，比如2、4、8、16、32這樣的，配的時(shí)候要容易些。配溶液的基本操作和器皿的選擇放到另外的章節(jié)再講。不是每個(gè)人的手藝都過關(guān)的。用微量移液器（俗稱槍）稱水的重量，做六次，CV能到1.5%以內(nèi)人才有資格去配標(biāo)準(zhǔn)品。
標(biāo)準(zhǔn)品是有保質(zhì)期的，在保質(zhì)期結(jié)束以前要把下一批的標(biāo)準(zhǔn)品做出來。通常會(huì)把兩批標(biāo)準(zhǔn)品放在一起跑，再加上10到20個(gè)病人樣品。濃度高和低的病人樣品都要有。用新舊的標(biāo)準(zhǔn)品測出來的數(shù)據(jù)不能差太大，最好是TEa的1/3或1/4以內(nèi)，一般是5%到10%。TEa留到以后再講。如果新標(biāo)準(zhǔn)品通過了這個(gè)檢測，下面有兩個(gè)選擇來決定新標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。一是用算出來的預(yù)期值，另一個(gè)是用測得的實(shí)際值。這里面的細(xì)微差異是公婆說理，我就不展開討論了。
標(biāo)準(zhǔn)品是把每個(gè)濃度都配出來，分裝、冷凍，還是就把最高的濃度配出來，用的當(dāng)天再做稀釋配其它濃度？這里面沒有硬性的規(guī)定，主要看你實(shí)驗(yàn)室的冰箱有多大。標(biāo)準(zhǔn)品是一次用完就扔掉，還是可以重復(fù)使用直到用光？這個(gè)也沒有規(guī)定，要看重復(fù)使用時(shí)，樣品的穩(wěn)定性和低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品被污染的情況有多頻繁。
標(biāo)準(zhǔn)品使用的頻率應(yīng)該怎樣定？目前為止，我看到的都是每批樣品都要做一套標(biāo)準(zhǔn)品。這一批跑的標(biāo)準(zhǔn)品不能借到別的批次病人樣品里去，除非有主管或主任的簽字。注意這里我應(yīng)到了"除非"這個(gè)詞。這就是綜合考慮遵循條例和實(shí)際工作情況的反映。按道理是不能這樣做的，可是如果你知道標(biāo)準(zhǔn)曲線一般不會(huì)變來變?nèi)ィ渲幸粭l明顯是因?yàn)橹貜?fù)使用被污染了，QC和其它指標(biāo)都正常時(shí)，借一條當(dāng)天干凈的標(biāo)準(zhǔn)曲線就是一個(gè)合理的變通選擇。當(dāng)然，這個(gè)選擇的權(quán)利不能下放到普通的實(shí)驗(yàn)員手里。
一批樣品里可不可以做兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，選好的哪一條呢？沒有硬性規(guī)定。但是如果跑兩次就又一次失敗的話，這個(gè)方法本身就不過硬，需要回爐重新加工。如果標(biāo)準(zhǔn)曲線每次變化不大，可不可以一條曲線一天內(nèi)重復(fù)使用，一個(gè)星期之內(nèi)呢？目前還不可以?？刹豢梢圆挥脴?biāo)準(zhǔn)曲線，只用內(nèi)標(biāo)和內(nèi)標(biāo)的濃度來算呢？這個(gè)想法很新穎，但還沒有被廣泛認(rèn)可，除非是做半定量。
標(biāo)準(zhǔn)品跑出來不一定都在一條直線上，會(huì)有偏差。偏差多少可以接受呢？一般是15%，最低點(diǎn)可以用20%。如果超出了這個(gè)范圍可以去掉嗎？答案是可以的，但是有限制。每四到五個(gè)點(diǎn)可以去掉一個(gè)點(diǎn)。如果沒有哪個(gè)點(diǎn)超過15%，但是QC出去了，可不可以去掉一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的點(diǎn)讓QC通過呢？答案是不可以的，除非有實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人的簽字。色譜峰可以手工調(diào)嗎？答案是不可以的，尤其是內(nèi)標(biāo)的峰。被測物質(zhì)的峰在低濃度時(shí)容易被雜峰干擾，手動(dòng)選峰可以有條件的接受。最低的點(diǎn)可以被排除嗎？一般不可以，除非所有的病人樣品都比第二低的點(diǎn)高。同理，如果把最高的點(diǎn)給排除了，所有高于第二個(gè)高點(diǎn)的樣品都要重做。
除了每個(gè)點(diǎn)的偏差，整條線的相關(guān)性 （correlation）要大于0.99或0.995。具體數(shù)值從實(shí)際結(jié)果中來。色譜峰的參數(shù)，比如保留時(shí)間，峰寬，baseline可以變化嗎？理論上是不可以的。但在實(shí)際應(yīng)用中，隨著色譜柱的使用次數(shù)增加，這些參數(shù)都會(huì)變。最好是在做方法驗(yàn)證時(shí)，把這些考慮進(jìn)去，確定舊柱子也能通過方法驗(yàn)證。這樣臨床時(shí)就有心理底氣去release舊柱子所產(chǎn)生的不是很理想的峰的結(jié)果。
聲明：本文章來源“臨床質(zhì)譜網(wǎng)”，作者：袁超博士，豪思生物已獲得臨床質(zhì)譜網(wǎng)和袁超博士授權(quán)，如需轉(zhuǎn)載，請(qǐng)聯(lián)系原作者！
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